拓扑替康、顺铂和泰素对宫颈癌HeLa细胞的抑制及放射增敏作用

　　宫颈癌严重危害妇女的身体健康。随着宫颈癌筛查体系的广泛普及，宫颈癌的发生率明显下降，但对晚期宫颈癌、复发宫颈癌的治疗仍很棘手。研究[1,2]显示，近50％的宫颈癌Ⅱb2一Ⅳ期患者无法手术，化疗效果也不佳；II b、Ⅲ和IV a期患者的5年总存活率分别为65％、40％和小于20％。放疗是宫颈癌进行综合治疗的重要方案。小剂量化学药物可提高放疗的敏感性，放疗和化疗(放化疗)结合已经成为晚期宫颈癌的标准治疗方案之一。其中，顺铂(Cisplatin，DDP)和泰素(Taxol，TAX)是目前较常用的同步放化疗药物之一。拓扑替康(Topo．tecan，TPT)作为放疗增敏剂广泛应用于人头颈部肿瘤、肺癌和妇科肿瘤(卵巢癌)的治疗[3,4]，但对晚期宫颈癌进行同步放化疗的报道较少。我们在先前的实验中研究了TPT对宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用，现将TPT的放射增敏作用与DDP、TAX放射增敏作用进行比较。

1 材料与方法

1．1材料　人宫颈癌HeLa细胞系购自中国科学院上海细胞库，37℃、5％CO2：条件下RPMI-1640培养液常规培养。TPT(贵州汉方制药有限公司，商品名：金喜素)；DDP(山东齐鲁制药有限公司)；TAX[百时美贵宝(上海)公司]。

1．2细胞抑制率检测采用MTr法检测 TPT、DDP和TAX对宫颈癌HeLa细胞增殖能力的影响。各药
物浓度梯度根据药物血峰值浓度(peak plasma concentration，PPC)设计。TPT、DDP和TAX的PPC分别为0．75、3．8和13．6 ug／mL。按不同药物浓度(TPT：0．075、0．75、7．5、75和250 ug／mL；DDP：0．004、0．04、0．4、4和40ug／mL；TAX：0．012、0．12、1．2、12和120 ug／mL)分为5组并设5个复孔，同时设立对照组。37℃、5％CO2，、饱和湿度条件培养24 h，实验孔中加入适量化疗药物工作液，对照孔加入等量RPMI-1640，分别培养24、48和72 h，每孔加入20ugMTT试剂(5 mg／mL)，混匀后继续培养4 h。加入二甲基亚砜150 uL后570 nm波长下检测各孔吸光度值，并计算D570nm值和细胞抑制率(inhibitory rate，IR)[5]。

1．3放射增敏实验
1．3．1照射方法：直线加速器(Simenze Oncor)6 mV　x线室温下避光等中心照射，射野20 cm×20 cm，剂量率为160 cGy／min，照射时培养皿上覆盖1．5 cm厚蜡膜。
1．3．2克隆形成实验拟合细胞生存曲线：设单纯照射组和加药照射组，放射线辐射剂量分别为0(单独化疗组)、2、4、6和8 Gy。将含1 000个单细胞的悬液接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％CO2：过夜贴壁后加入各浓度药物。照射组调整药物终浓度为IC50并作用24 h和48 h后，予放射线辐射后继续培养8—9 d，计数各组克隆数，并计算细胞存活分数(surriving　fraction，SF)[5]。根据单击多靶模型SF=1-(1-e-D/Do。)n，拟合TPT、DDP和TAX各组中细胞存活曲线(包括单独放疗组、放射增敏24 h组和放射增敏48 h组)，计算外推值(N)，平均致死剂量(Do)和
准阈剂量(Dq)，以及放射增敏比(sensitization　enhancement ratio。SER)。N值是曲线指数部分外延至Y轴的截距，称外推值，反映细胞对放射引起损伤的修复能力；Do为曲线指数区下降63％所需的剂量；存活曲线的直线部分斜率的倒数为Do值，称为细胞平均致死剂量，为使存活率下降63％所需剂量；Dq为细胞受损所需准阈剂量，由纵坐标1．0处作一条与横坐标的平行线，与外推线的交点在横坐标上投影点的数值即为Dq，称准域剂量，代表细胞累积亚致死性损伤能力，为克服肩区的剂量；SER为单纯照射组与加药照射组的Do值之比。

1．4统计学方法　采用SPSS 11．0软件进行统计学分析，Ic50计算采用Probit Regression分析，组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，组间率的比较采用卡方检验。P<0．05表示差异具有统计学意义。{NextPage}

2结果

2．1 TPT、DDP和TAX对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用TPT对HeLa细胞的抑制率随作用时间的延长而逐渐增加，TPT作用24、48和72 h对宫颈癌HeLa细胞的IC50分别为8．0、2．6和0．8 Iug／mL；DDP作用宫颈癌HeLa细胞的IC50。分别为2．4、0．7和0．1 ug／mL；TAX作用宫颈癌HeLa细胞的IC5o分别为0．3、0．1、0．0ug／mL(表1—3)。

2．2 TPT、DDP和TAX对HeLa细胞的放射增敏作用TPT、DDP和TAX单独化疗组24 h和48 h的细胞存活分数分别为59％和39％，61％和39％。57％和32％。单独放疗组中，随着放射线剂量的增加，细胞存活分数逐渐降低，照射剂量为2 Gy时，存活分数为73．3％；照射剂量为8 Gy，存活分数为2％。放射增敏组中，化疗药物作用时间越长，细胞存活分数越低，同一照射剂量下，放射增敏组细胞存活分数明显小于单独放疗组和单独化疗组(P<O．05)(表4)。根据单击多靶模型方程计算各组放射参数，结果显示单独放疗组N为4．785，Do为1．437，Dq为1．928；放射增敏组中，TPT、DDP和TAX放射增敏24 h和48 h后，放射增敏比分别为1．167和1．344；1．314和1．538；1．076和1．316(表5)。{NextPage}

3讨论

　　宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一。宫颈癌常规治疗手段为放射治疗和手术治疗。晚期宫颈癌
(Ⅱb2-Ⅳ期)患者近50％无法手术，化疗效果也不佳。大量基础研究和临床实验证实，同步放化疗能够明显提高晚期宫颈癌患者有效率，延长无进展生存期和总存活率，改善晚期宫颈癌患者预后，已成为晚期宫颈癌患者的常规治疗[6]。放射增敏剂的作用机制至今尚不完全明确，主要有以下几方面：①改善肿瘤局部缺氧的微环境；②氧疗可以提高血液中氧含量，改善瘤细胞的氧合状态，提高放射敏感性；③血管生长抑制剂可降低肿瘤间质内压，增加肿瘤灌注，改善肿瘤乏氧状态，提高肿瘤的放射敏感性。[7]。④直接增加细胞损伤，如DNA一蛋白质交联、DNA单链断裂、DNA双链断裂、碱基破坏或脱落等，破坏生物靶分子DNA结构和功能引起细胞损伤[8]；⑤促进细胞凋亡；⑥抑制细胞损伤修复功能；⑦影响细胞周期动力学，处于不同周期的肿瘤细胞对电离辐射敏感程度不一，G1／S期边界及G2／M期敏感性最高，而S期尤其是晚S期最低，G1期有一定抵抗性；⑧清除自由基。

　　TPT是一种新型的半合成喜树碱衍生物，作用于拓扑异构酶I(Topo I)抑制其功能。目前TPT多用于化疗敏感、一线治疗失败的小细胞肺癌和晚期卵巢癌的二线治疗[9-12]。TPT联合DDP(TPT+DDP)方案在晚期或复发宫颈癌的治疗上取得了不错的效果[13-15]。Bookman等[16]对45例晚期宫颈鳞癌患者行TPT化疗，缓解率(完全缓解+部分缓解)为12．5％，病情无明显改变的为37．5％，中位无病变进展生存时间为21月。Gynecologic Oncology Group在晚期宫颈癌患者中行临床随机比较单用DDP组、DDP联合TPT组的化疗效果，结果发现DDP组中位生存时间为6．5月，联合化疗组为9．4月，差异有统计学意义(P=0．017)；两组无进展生存时间分别为2．9月和4．6月，有效率分别为13％和27％，差异也有统计学意义(P<0．05}[13]。

　　虽然TPT作为放疗增敏剂在肺癌、头颈部肿瘤和卵巢癌等治疗中取得了不错的效果[3-4,17]，但用于晚期宫颈癌患者的报道罕见，Bell等[18]入组6例宫颈癌患者(I b期1例；II b期4例；11I b期l例)，予以TPT联合同步放疗行临床I期试验，但仅对化疗剂量的耐受性进行报道，未对同步放化疗结果进行报道。T门的放射增敏作用尚不明确，可能与Top I功能抑制及影响肿瘤细胞DNA合成相关。

　　DDP和TAX对宫颈癌HeLa细胞有明显抑制和放射增敏作用。但对于晚期宫颈癌易于复发、转移或难治性的特点需要更多的治疗选择。TPT在卵巢癌和肺癌等肿瘤的治疗上表现出较好的抗肿瘤能力以及放疗增敏作用。目前，TPT联合DDP用于晚期宫颈癌化疗，但联合放疗治疗宫颈癌则少有报道。本研究显示，TPT对宫颈癌HeLa细胞具有抑制和放射增敏作用，其中放射增敏作用有大于TAX的趋势。TPT作为放疗增敏剂应用于晚期宫颈癌的治疗前景良好，值得进一步研究。