【摘要】目的 探讨中期因子（midkine,MK）、Ki-67、CD34在正常子宫内膜组织、子宫内膜上皮内瘤变（EIN）组织、子宫内膜癌组织中的表达及其在生物学行为方面的意义。方法 15例正常子宫内膜组织、20例EIN组织及30例子宫内膜癌组织标本，应用免疫组织化学方法（SP法）分别检测MK、Ki-67、CD34的表达情况，并进行统计学分析。结果 MK、Ki-67、CD34在正常子宫内膜、EIN和子宫内膜癌组织中的表达逐渐升高，其在3种组织中表达之间的差异具有统计学意义（P<0.05）；MK、Ki-67和CD34的表达与子宫内膜癌的临床分期、组织学分级、淋巴结转移、肿瘤肌层浸润程度等有关（P<0.05），而与宫内膜癌患者的年龄无关（P>0.05）；MK与Ki-67在子宫内膜癌中的表达呈正相关（r=0.781,P<0.05）。结论 MK的阳性表达与子宫内膜癌的发生、发展和预后有关，可联合Ki-67和CD34作为一组有价值的肿瘤标记和预后指标。

　　【关键词】子宫内膜癌；中期因子；Ki-67;CD34

　　The expression and significance of midkine, Ki-67 and CD34 in endometrial carcinoma

　　WU Xiaoyan, LU Xiaoyuan

　　（1. Grade 2007, Graduate School, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002）

　　Abstract: Objective To investigate the expressions and significance of biological behavior of midkine, Ki-67 and CD34 in normal endometrial tissues, endometrial intraepithelial neoplasia （EIN） and endometrial carcinoma. Methods A total of 15 samples of normal endometrial tissue, 20 samples of endometrial intraepithelial neoplasia and 30 samples of endometrial carcinoma were examined for the expression of MK, Ki-67 and CD34 by immunohistochemical method （SP） and statistical analysis of the results. Results The positive expressions of MK, Ki-67 and CD34 in endometrial carcinoma were significantly higher than in endometrial intraepithelial neoplasia and normal endometrial tissue （P<0.05） . The expression of MK, Ki-67 and CD34 was associated significantly with a clinical staging, grading, lymphatic metastasis and the degree of myometrial infiltration of the tumor （P<0.05）， while it was not associated with age of the patients （P>0.05）。 The expression of MK was positively correlated with that of Ki-67 and CD34 in endometrial carcinoma （r=0.781,P<0.05）。 Conclusion The positive expressions of MK are significantly correlated with the pathogenesis, progression and prognosis of endometrial carcinoma. MK in combination with Ki-67 and CD34 may serve as a set of valuable markers and prognostic indicators of endometrial carcinoma.

　　Key words: endometrial carcinoma; midkine; Ki-67; CD34{NextPage}

　　分子生物学技术研究表明，肿瘤的形成和进展是一个多因素参与、多基因改变的复杂过程。目前研究发现，肿瘤的生长、浸润和转移与新生血管形成有关，血管生成和肿瘤生长的关系已经成为肿瘤研究的热点，血管的生成是肿瘤细胞生长、侵袭和转移的基础。中期因子（midkine, MK）是新发现的肝素结合生长因子，可诱导神经元分化、诱导PC12细胞分化，还具有增强大动脉内皮细胞纤溶酶原激活物活性的作用。MK在多种恶性肿瘤中有过表达，并与肿瘤的发生、演进和预后等因素有关[1-3].Ki-67是一种增殖细胞核抗原，其表达能反映肿瘤的增殖活性，已成为肿瘤生物学行为的可靠指标[4-5]. CD34是近年在研究肿瘤新生血管时采用的血管内皮细胞标志物[6],在血管内皮细胞上可以结合转化生长因子β（TGF-β）的受体蛋白，在增殖的内皮细胞和血管生成旺盛的肿瘤组织内新生血管内皮细胞中呈过表达，而在正常成熟组织的血管内皮细胞中弱表达或不表达。CD34不与大血管内皮细胞发生反应，但与肿瘤组织内的微血管反应强烈，它的表达反映了肿瘤血管的生成，用以计数微血管密度（MVD），在肿瘤的诊断、预后及治疗等诸方面均表现出良好的发展前景。MK与子宫内膜癌关系的研究国内鲜见报道。本文采用免疫组织化学方法检测子宫内膜腺癌（endometrial adenocarcinoma,EA）组织中MK、CD34、Ki-67的表达情况，探讨其与子宫内膜腺癌生物学行为的关系及对预后的意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　选取徐州医学院附属医院 2007 年 9月至 2009 年 4 月正常子宫内膜（NC）组织标本15例、子宫内膜上皮内瘤变（EIN）组织标本20例及子宫内膜腺癌组织标本 30 例进行研究。同时复习所有标本来源病例的临床资料。

　　子宫内膜癌按FIGO（国际妇产科联盟，2000年）诊断标准进行临床分期。患者平均年龄 （55.23±5.45）岁（42~65 岁）， ≤50岁的患者 10 例，>50 岁的患者20例。临床分期：Ⅰ期 11 例，Ⅱ期11例，Ⅲ期 8例。组织学分级：高分化10 例，中低分化20例。淋巴结转移8例，无淋巴结转移22例。肌层浸润程度：无或≤1/2肌层12例，>1/2肌层18例。

　　取同期正常子宫内膜组织 15 例（因阴道出血诊刮病检示增生期子宫内膜或分泌期子宫内膜）为对照组，患者平均年龄（53.10±4.38）岁（35~55岁）。根据妇产科学第7版诊断标准，选择子宫内膜上皮内瘤变（EIN） 20例，患者平均年龄（50.02±6.48）岁（37~68 岁）。

　　各组患者年龄差异无统计学意义（P>0.05）。所有标本均经过病理科医师再次阅片证实并进行病理分级，所有肿瘤病例取材前均未经过放化疗或生物学治疗。

　　1.2 试剂

　　兔抗人 midkine单克隆抗体 （武汉博士德生物有限责任公司），鼠抗人CD34单克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司），鼠抗人Ki-67单克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司），免疫组化染色（SP法）试剂盒（北京中杉生物技术有限公司），浓缩型DAB试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）。{NextPage}

　　1.3 免疫组化方法

　　标本组织常规石蜡包埋，4 μm 连续切片6 张，SP法分别做MK、Ki-67 和CD34的免疫组化染色。已知阳性切片作阳性对照，用PBS 代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　以肿瘤细胞胞质或胞膜出现清晰棕黄色染色为MK阳性细胞。每张切片在400倍镜下选择切片平展、细胞形态和组织结构清晰的10个视野，每个视野计数100个细胞，MK阳性细胞数<10％者为阴性（-），MK阳性细胞数10％~20％者为弱阳性（+），MK阳性细胞数>20％者为强阳性（++）。

　　CD34在肿瘤组织中阳性表达均位于血管内皮细胞的细胞质中，呈棕黄色。

　　Ki-67 阳性判定：肿瘤细胞核出现清晰棕黄色染色颗粒即为Ki-67阳性细胞。整张切片在 400 倍镜下选择切片平展、细胞形态和组织结构清晰的 10 个视野，每个视野计数100个细胞，组织中Ki-67阳性细胞数<10％者为阴性（-），Ki-67阳性细胞数10％~20％者为弱阳性（+），Ki-67阳性细胞数>20％者为强阳性（++）。

　　MVD 计数：按 Weidner等[7]方法。用抗CD34 标记记录MVD.在低倍显微镜（×100）下对整张组织切片找出5个血管内皮细胞染色密集区域（热点），然后每个区域在高倍（×400）视野下分别计数热点内染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，只要它们和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就视为一个微血管。取 5 个区域的平均数即为 MVD.

　　1.5 统计学处理

　　应用SPSS 13.0统计软件，采用确切概率法、方差分析、t检验及Pearson相关分析进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 MK、Ki-67、CD34在正常子宫内膜、EIN、子宫内膜癌组织中的表达

　　2.1.1 MK在正常子宫内膜、子宫内膜上皮内瘤变、子宫内膜癌组织中的表达

　　MK在肿瘤组织中阳性表达均位于细胞膜和（或） 细胞质中，呈黄色或棕黄色颗粒，见图1.3种组织中MK表达率分别为0（0/15）、40.0％（8/20）、70.0％（21/30），3组间差异有统计学意义（P<0.05），组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1.{NextPage}

　　2.1.2 Ki-67在正常子宫内膜、子宫内膜上皮内瘤变、子宫内膜癌组织中的表达

　　3种组织中Ki-67表达率分别为 6.7％（1/15）、30.0％（6/20）、63.3％（19/30），3组间差异有统计学意义（P<0.05），组间两两比较，子宫内膜癌组织中Ki-67的阳性表达率显著高于正常子宫内膜组织（P<0.05）和子宫内膜上皮内瘤变组织（P<0.05），而子宫内膜上皮内瘤变组织和正常子宫内膜组织中的Ki-67阳性表达率无显著性差异（P>0.05）。

　　2.1.3 CD34在正常子宫内膜、子宫内膜上皮内瘤变、子宫内膜癌组织中的表达

　　3种组织中 MVD 分别为（13.33±4.11）、（25.30±2.59）、（35.20±3.78）条/HP,3组间差异有统计学意义（F=173.00,P<0.05），组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1.

　　2.2 MK、Ki-67、CD34与子宫内膜癌临床病理特征的关系

　　MK、Ki-67、CD34的表达与子宫内膜癌的临床分期、组织学分级、肿瘤肌层浸润程度、淋巴结有无转移有关，而与子宫内膜癌患者的年龄无关。见表2.表2 MK的表达与子宫内膜癌临床病理特征的关系（略）

　　2.3 MK与CD34、Ki-67在子宫内膜癌中表达的相互关系

　　2.3.1 MK与CD34在子宫内膜癌中表达的关系

　　MK阳性表达患者的MVD显著大于MK阴性表达患者（P<0.05）。表明伴随 MK 的表达，MVD 值明显增加，肿瘤新生血管明显增多。

　　2.3.2 MK与Ki-67在子宫内膜癌中表达的相关性

　　MK与Ki-67在子宫内膜癌中的表达呈正相关（r=0.781,P<0.05）。

　　3 讨论

　　子宫内膜癌是女性生殖道常见恶性肿瘤之一，占女性生殖道恶性肿瘤的20％~30％.近年来，伴随着女性的高龄化，子宫内膜癌的发病率呈上升趋势，而且发病年龄趋年轻化。许多专家提出肿瘤的生长和转移依赖肿瘤组织的微血管形成。因此，血管生成和肿瘤生长的关系即成为肿瘤研究的热点，并为进一步指导临床治疗及判断预后提供了新的思路。{NextPage}

　　MK是一个新的肝素结合性生长因子，成人的正常组织有MK的少量表达，大部分癌包括食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌和Wilms′瘤等均以组织非依赖方式高水平表达MK[8-9] .殷正丰等[10]的实验结果也显示，在肝癌中MK不仅表达在肝癌细胞，在肝癌细胞外间质中的血管内弹力膜层及内皮细胞也有表达，尤以密集的血管处明显。肿瘤的血管内皮细胞增殖较正常组织高20~2 000倍，它形成的新生血管是肿瘤生长和转移的基础。肿瘤细胞通过新生的血管组织获得必要的养分，带走大量的代谢产物，同时肿瘤诱生的血管基底膜薄而易断裂，癌细胞易侵入血管，经由血液途径发生远处转移。本实验显示，MK在正常子宫内膜组织、子宫内膜上皮内瘤变组织、子宫内膜癌组织中的表达逐渐升高，差异有统计学意义。且MK的表达与子宫内膜癌组织学分级、临床分期、淋巴转移、肌层浸润程度相关， 提示MK不仅可望成为子宫内膜癌早期诊断的标志物， 并可作为治疗及判断预后的一个指标。

　　CD34作为跨膜单链糖蛋白，相对分子质量为（105~120）×103,定位于1号染色体长臂，主要表达在造血前体细胞和血管内皮细胞上，又称为人原始造血细胞抗原（human hepatopoietic proenitorcell antigen），与血管生成密切相关，是内皮细胞特异的标记物，特别对肿瘤内毛细血管、小血管内皮细胞表达的稳定性和敏感性较强，该抗体特异地标记肿瘤血管而对淋巴细胞和基质细胞不存在交叉性反应[11]. CD34在增殖的内皮细胞和血管生成旺盛的肿瘤组织内新生血管内皮细胞中呈过表达，而在正常成熟组织的血管内皮细胞中弱表达或不表达[12].这为免疫组化研究提供了依据。本实验检测CD34的表达作为肿瘤组织血管生成的指标，子宫内膜癌组织和子宫内膜上皮内瘤变组织、正常子宫内膜组织的MVD有显著差异；并且随着子宫内膜癌的临床分期、组织学分级的增加，以及淋巴结转移的出现和肌层浸润程度的增强， MVD值明显增加。结果提示子宫内膜癌的生长、发展和转移有赖于血管生成。

　　大量研究已证实细胞过度增殖是许多肿瘤发生与发展的基础。Ki-67又称为细胞核增殖抗原， 是一种DNA结合蛋白， 定位于细胞核。它存在于增殖细胞中， 参与驱动细胞周期的调控网络， 除G1期、G1早期外，其他各期均有表达，M期达到高峰。因其半衰期短， 细胞脱离增殖周期后迅速降解， 因此被视为较全面反映细胞群体增殖活性的指标[13].有研究表明，它与很多恶性肿瘤的发展、转移及预后具有相关性[14].本实验检测Ki-67表达作为增殖活性指标，子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织、子宫内膜上皮内瘤变的阳性表达率有显著差异，说明子宫内膜癌的发生与细胞增殖有关，考虑Ki-67可作为鉴别肿瘤良、恶性的辅助指标。而正常子宫内膜组织与子宫内膜上皮内瘤变组织相比无统计学差异，可能还需要增加样本量以进一步研究。同时实验结果还显示，随着子宫内膜癌的临床病理分期的增加、肿瘤细胞分级的增高、肌层浸润程度的加深和淋巴结的转移， Ki-67阳性表达率呈上升趋势。因此认为Ki-67与肿瘤恶性程度呈正相关，可以作为评价子宫内膜癌增殖分化状态、判断肿瘤侵袭力的重要标志。

　　MK、CD34和Ki-67可能共同参与子宫内膜癌发生、生长和转移。我们还发现MK与代表肿瘤组织新生血管的CD34所标记的MVD值有关，同时MK在肿瘤组织的新生血管内皮细胞基质细胞也有表达，因此推测，MK可能具有刺激内皮细胞增殖、促进肿瘤血管生成的作用。实验结果还提示，MK与Ki-67在子宫内膜癌的表达有一定相关性，两者可能是互相促进作用，协同致子宫内膜癌的发生。

　　MK是一个分泌性肝素结合蛋白，当组织中MK生成达一定量时，循环系统中MK水平开始升高。有研究结果显示在超过60％的成人癌组织中可检测到MK水平升高，去除了肿瘤后血清MK水平即下降。同时，MK、CD34和Ki-67这三者在子宫内膜癌的高水平表达及它们之间的相关性提示，在临床上我们可单独测定MK或联合测定CD34和Ki-67作为子宫内膜癌的诊断依据，以提高确诊率，并预测预后。{NextPage}

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