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摘要
目的 探讨激素替代周期冻融优质单囊胚移植活产率的影响因素，分析冻融胚胎移植（FET）周期选择性单囊胚移植的适应证。
方法 回顾性分析2014年1月至2017年12月期间在河南省人民医院生殖中心行激素替代方案冻融胚胎移植（HRT-FET）的1675个优质单囊胚移植周期，采用单因素分析和多元logistic回归分析影响活产率的相关因素，根据多元logistic回归分析结果建立活产率的预测模型。
结果 单因素分析结果显示，年龄（P<0.000 1）、体质量指数（BMI）（P=0.012 8）、不孕年限（P<0.000 1）、FET次数（P<0.000 1）、内膜厚度（P=0.024 9）、不孕类型（P=0.001 7）、移植胚胎发育时间（P<0.000 1）为活产率的影响因素。多元logistic回归分析显示，年龄（OR=0.98，P=0.037 7）、FET次数（OR=0.75，P<0.000 1）、不孕年限（OR=0.94，P=0.003 7）、内膜厚度（OR=1.07，P=0.020 3）、不孕类型（以原发不孕为对照组，继发不孕组OR=0.77，P=0.014 1）、囊胚发育时间［以第5日（D5）为对照组，第6日（D6）组OR=0.45，P<0.000 1］是活产率的影响因素（P<0.05）。多元logistic回归分析调整其他因素的影响后显示BMI并不影响活产率（OR=0.97，P=0.066 5）。分类多元logistic回归分析结果显示，年龄>38岁（OR=0.65，P=0.015 6）、FET次数>1次（OR=0.45，P<0.000 1；OR=0.32，P<0.000 1；OR=0.30，P<0.000 1）时患者活产率下降；子宫内膜厚度为10.0~11.9 mm时，活产率最佳（OR=1.84，P=0.000 5）。预测模型在最佳阈值（约登指数最大时，敏感度+特异度最大的分界值）敏感度为0.63，特异度为0.64，曲线下面积（AUC）=0.69，模型预测能力中等。
结论 囊胚发育时间、不孕类型、胚胎移植次数是影响优质单囊胚HRT-FET活产率的主要因素。HRT-FET选择性单囊胚移植的适应证包括以下条件：原发不孕、年龄≤38岁、首次FET、子宫内膜厚度10.0~11.9 mm、D5优质囊胚。
【关键词】 激素替代周期；冻融胚胎移植；单囊胚移植；活产率
基金项目：国家科技攻关计划（2018YFC1002106）
DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20190820-00365
近期数据显示体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的临床妊娠率可以达到50%~60%，其多胎妊娠率达到甚至超过30%，增加了妊娠期母婴并发症[1-2]，导致医疗资源的浪费，增加经济负担。既往评判IVF助孕结局的关键指标是临床妊娠率、胚胎种植率、活产率和累积妊娠率等。随着实验室和临床技术的改进，试管婴儿助孕的目标已经从实现妊娠转变为缩小辅助受孕和自然受孕之间围产期结果的差距[3]。因此,近年来生殖医学专家提倡使用单活胎分娩率来评估辅助生殖技术的安全性和有效性，甚至将多胎妊娠定义为辅助生殖技术并发症，进行严格管控。
玻璃化冷冻技术的出现及在临床广泛应用使冷冻胚胎及囊胚的复苏率有了很大提高，冻融胚胎移植(FET)周期数快速增长。有研究认为,冻融单囊胚移植与新鲜单囊胚移植比较可以得到更好的临床结局并且可以降低卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生，因此建议在该人群中逐渐推广全部胚胎冻存[4]。一次性移植2~3枚胚胎是引起辅助生殖技术多胎妊娠率高的主要原因，选择性单胚胎移植是降低多胎妊娠率的有效措施[5]。当然单枚卵裂期胚胎移植在降低多胎妊娠率的同时也会导致临床妊娠率及活产率的降低[6-7]，由于我国辅助生殖技术助孕费用未纳入医疗保险报销范围，多次助孕将增加患者的经济负担，因此单个卵裂期胚胎移植在临床上的推广困难重重。单囊胚移植尤其是优质单囊胚移植可以有效降低多胎妊娠率，并且与卵裂期胚胎相比较有更高的临床妊娠率和活产率[8]，因此选择性单囊胚FET更能被医生和患者接受。
然而，对于在何种情况下建议患者行单囊胚移植，临床上尚无统一标准，全面推广选择性单囊胚FET的条件尚不成熟。本研究通过对1675个移植单枚优质囊胚激素替代方案(HRT)-FET周期临床资料的回顾性分析，探讨影响HRT-FET优质单囊胚移植周期临床结局的相关因素，并建立活产率的预测模型，以指导临床制定选择性单囊胚移植的适应证。
资料与方法
1.研究对象
回顾性分析2014年1月—2017年12月期间在河南省人民医院生殖中心行HRT-FET的优质单囊胚移植周期的临床资料。纳入标准：①采用激素替代方案准备内膜的FET周期；②移植1枚优质囊胚期胚胎。排除标准：①夫妻双方任何一方染色体异常；②诊断为先天性或后天子宫畸形(如子宫畸形、子宫腺肌症、黏膜下肌瘤)；③影响妊娠结局的子宫内膜因素,如子宫内膜息肉、宫腔粘连、子宫内膜结核史、输卵管积水回流子宫腔；④植入前遗传学诊断助孕周期。本研究符合《赫尔辛基宣言》。
2.IVF-ET临床方案
子宫内膜准备方案均使用HRT方案。患者从月经周期或者药物撤退性出血的第2~4日开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，1mg/片，德国拜耳公司），4~6mg/d×7d；7d后超声监测子宫内膜厚度并调整戊酸雌二醇剂量，最大剂量为8mg/d，使用时间为11~20d。尽量使患者子宫内膜厚度≥8 mm或者达到取卵周期人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射日内膜厚度时，使用孕酮转化内膜，戊酸雌二醇剂量维持不变同时给予黄体酮阴道缓释凝胶（雪诺同，90mg/支，德国默克雪兰诺公司）1支/d，联合口服地屈孕酮片（达芙通，10mg/片，美国雅培制药有限公司）20mg/d，转化内膜第6日进行囊胚移植术。移植后14 d查血β-hCG，若≥50 IU/L，视为生化妊娠，激素补充继续维持，超声检查到胎心后开始逐渐减量至孕10周停药。
3.移植囊胚评分标准
囊胚评分按照Gardner评分系统[9]进行，根据囊腔扩张程度进行分级。囊腔不足胚胎体积的50％为1级；≥50％为2级；囊腔几乎占满整个胚胎为3级；囊腔扩张、透明带变薄为4级；囊胚开始从透明带破口孵出为5级；囊胚完全孵出，脱离透明带为6级。对处于3~6级的囊胚，进一步对内细胞团(inner cell mass，ICM)和滋养外胚层(trophectoderm，TE)进行评分。ICM评分：细胞数量多且分布紧密成团，突起明显为A级；细胞数量较少且分布松散为B级；细胞数量非常少，难以辨别明显的ICM结构则为C级。TE评分：较多的细胞形成连接紧密的上皮层为A级；较少的细胞，上皮样结构不连续，连接松散为B级；细胞少且体积大为C级。4BB及以上囊胚定义为优质囊胚。
4.观察指标定义
以囊胚移植后14 d测定血β-hCG≥50 IU/L为生化妊娠，移植后4周行阴道超声检查，宫腔内外见妊娠囊确定为临床妊娠；发生在12周以前的流产定义为早期流产。评估指标包括临床妊娠率、早期流产率、活产率。临床妊娠率=临床妊娠周期数/总周期数×100%;早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率=活产周期数/总周期数×100%。以活产率为主要观测指标。
5.统计学方法
应用基于R软件的EmpowerStats进行统计分析，呈正态分布的数据以均数±标准差（Mean±SD）表示，组间变量比较使用独立样本t检验，计数资料以率(%)表示，组间数据比较采用χ2检验或Fisher精确检验，对可能影响妊娠结局的相关因素进行单因素分析，对差异有统计学意义的影响因素再进行多元logistic回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。用饱和模型（full mode）建立列线预测模型，采用自抽样法（bootstrap sampling method）对列线模型进行内部验证，利用曲线下面积(AUC)来评估列线模型的预测性能。
结果
1.患者一般情况及周期结局
共收集到1675个进行优质单囊胚移植的FET周期，共931个周期获得活产，活产率为55.6%。周期总妊娠率为66.0%，早期流产率为11.5%，详见表1。
2.影响优质单囊胚FET的单因素分析
将可能影响患者活产率的因素进行单因素分析，结果显示年龄、体质量指数（BMI）、不孕年限、FET次数、内膜厚度、不孕类型、移植胚胎发育时间均对活产率有影响，差异有统计学意义（P均<0.05），详见表2。
3.影响活产率的多元logistic回归分析
应用多元logistic回归分析分析年龄、不孕年限、FET次数、BMI、内膜厚度、不孕类型、移植胚胎发育时间对活产率的影响，分析某一因素对活产率的影响时将其他因素作为混杂因素带入logistic回归方程进行调整。调整后结果显示,年龄、不孕年限、FET次数、内膜厚度、不孕类型、囊胚发育时间仍是活产率的影响因素(P均<0.05)；调整混杂因素后BMI并不影响活产率，详见表3。
4.影响活产率因素的亚组分析
将年龄、不孕年限、FET次数、内膜厚度、不孕类型根据表1进行亚组分组，通过分类多元logistic回归分析寻找适合优质单囊胚移植的亚组。结果显示年龄>38岁及FET次数>1次时患者活产率下降（OR<1，P<0.05）；内膜厚度10.0~11.9 mm时活产率最佳(OR=1.84,P=0.000 5)，详见表4。
5.预测模型与受试者工作特征（ROC）曲线分析
将年龄、不孕年限、FET次数、内膜厚度、不孕类型、移植胚胎发育时间设置为预测活产率的自变量，建立列线图预测模型（图1），利用AUC来评估模型的预测性能（图2）。所得预测模型为：1.65-0.30×FET次数-0.02×年龄 +0.06×内膜厚度-0.29×(继发不孕=1)-0.06×不孕年限 -0.81×(D6=1)（AUC=0.69），在最佳阈值（约登指数最大时，敏感度+特异度最大的分界值）敏感度为0.63，特异度为0.64，模型预测能力中等。采用自抽样法对列线模型进行内部验证（重采样次数=500），AUC=0.69,在最佳阈值（0.46）敏感度为0.57，特异度为0.71。经内部验证，AUC基本不变，该模型较稳定。
讨论
近年囊胚移植尤其是选择性单囊胚移植在我国生殖中心比例越来越大，得益于以下几个方面：首先，随着二孩政策的放开使患者对于双胎或者多胎妊娠的要求不再迫切，更能理性规避多胎妊娠的母婴并发症；随着胚胎培养体系不断改进，玻璃化冷冻技术的广泛应用是囊胚培养及移植的技术保障[10]；最后，医生尤其是生殖科医生、产科医生及新生儿科医生对于多胎妊娠的并发症、危害、风险的科普及宣教，使更多患者能够认识到多胎妊娠的危害和带来的家庭社会负担。但是，目前临床上对于选择性单囊胚移植的适应人群尚不明确。众所周知，影响临床结局的因素包括患者基本情况（如年龄、BMI、卵巢功能）、内膜厚度、胚胎质量和数量、内膜与胚胎的同步性等[11-12]。本研究入组患者均使用HRT-FET准备内膜，胚胎移植时间统一，且均移植1枚优质囊胚，排除了控制性促排卵新鲜移植周期雌、孕激素及降调节药物的使用对妊娠结局的影响[13]。因此，本研究影响临床结局的主要因素是患者年龄、不孕年限、内膜厚度等客观指标，可以依此来讨论适合选择性单囊胚移植的人群特征并建立预测优质单囊胚活产率的模型。
既往研究认为，患者年龄、移植日内膜厚度、囊胚形成时间是影响临床结局的重要因素，但是不孕类型、不孕年限、BMI及FET次数是否可以预测临床结局尚有争论[14-16]。多数研究认为，<35岁患者可以得到更好的临床结局[5,17]，但是对于移植优质囊胚的患者影响其活产率的年龄节点并不明确，本研究分类logistic回归分析显示，年龄>38岁的患者活产率明显下降。近期2篇关于子宫内膜厚度对临床结局影响的Meta分析认为,内膜厚度是否独立影响临床结局尚不明确，使用子宫内膜厚度作为周期取消或全部胚胎冷冻的指标并不合理[18-19]。目前已经发表的文献尚无法确定子宫内膜厚度对临床结局的影响，而我们的数据显示内膜厚度在10.0~11.9 mm活产率最高。一项纳入1347个单囊胚FET周期的研究认为，D5和D6囊胚FET结局的差异是由于D6胚胎质量较差造成的[20]。Taylor等[21]的研究显示在D6囊胚中非整倍体率相较于D5囊胚增加10%。Haas等[22]认为与D5冷冻囊胚相比，D6冷冻囊胚FET周期的妊娠率显著降低，即使形态学评估认为它们均是优质胚胎。我们的结果与上述研究结果一致，D5优质单囊胚移植结果优于D6优质单囊胚。
有研究认为，肥胖患者的卵巢对促性腺激素(Gn)不敏感，导致患者促排卵周期Gn用量大,流产率增加[23-25]。Rittenberg等[26]的Meta分析认为，肥胖可能影响患者卵子质量而降低活产率。本研究中BMI在单因素分析时对活产率有影响，在多元回归分析中对活产率并无影响。所以排除促排卵药物及胚胎质量对患者临床结局的影响后，BMI可能并不影响移植优质单囊胚FET周期的活产率。Vaegter 等[17]的一项含有8400个单胚胎移植周期的研究认为，既往从未进行过IVF治疗，未取得过活产的患者与既往进行过1~6次IVF治疗且有过1次活产的患者比较，前者妊娠结局更好。本研究结果提示与继发不孕相比，原发不孕患者在移植优质单囊胚的FET周期活产率更高。另外本研究还观察到随着FET次数及不孕年限的增加，患者取得活产逐渐下降，与以往文献结果一致[27-28]。
本研究结果显示对于进行优质单囊胚移植的HRT-FET周期，影响活产率的因素包括患者年龄、不孕年限、不孕类型、FET次数、内膜厚度、囊胚发育时间。分类多元回归分析结果提示：原发不孕女性，年龄≤38岁、首次FET、内膜厚度10.0~11.9 mm，移植D5优质囊胚可以获得理想的活产率。虽然我们通过统计学方法找到了影响活产率的多个因素，并进一步分析了获得理想活产率的最佳条件，但是针对每个患者来说，往往需要综合考虑多个影响因素，并评估不同因素对临床结局影响力的大小，因此我们通过统计软件建立了预测HRT-FET优质单囊胚移植活产率的模型，预测模型中对应每个因素的系数可以反映其对活产率影响的大小，根据预测模型得出囊胚发育时间、不孕类型、FET次数是影响优质单囊胚HRT-FET活产率的主要因素。
综上所述,HRT-FET选择性单囊胚移植的适应证包括以下条件：原发不孕、年龄≤38岁、首次FET、子宫内膜厚度10.0~11.9 mm、D5优质囊胚。影响优质单囊胚HRT-FET活产率的主要因素是囊胚发育时间、不孕类型、胚胎移植次数。本研究建立了HRT-FET选择性单囊胚移植活产率的预测模型，可以更为直观地预测患者的活产率，便于选择性单囊胚移植在临床上的应用和推广。本研究为单中心研究，样本量不大，仍需扩大样本量行多中心研究，进一步验证预测模型。
参考文献（略）
