摘要

子宫内膜异位症患者常伴有卵泡发育迟缓、卵母细胞成熟障碍等问题，严重影响患者生育能力。子宫内膜异位症患者颗粒细胞凋亡及氧化应激事件的发生、细胞能量代谢及类固醇合成能力受损可能是其卵泡发育异常、卵母细胞质量下降的原因。而卵巢内膜异位囊肿引起炎症反应发生，使卵泡过度激活、卵巢皮质纤维化，直接影响卵巢储备。本文对子宫内膜异位症患者卵泡颗粒细胞凋亡及氧化应激事件、类固醇激素合成及能量代谢功能异常进行讨论，并从炎症反应的角度解释内膜异位囊肿对卵巢储备的不利影响。

【关键词】 子宫内膜异位症；颗粒细胞；氧化应激；卵泡发育；能量代谢

基金项目：国家重点研发项目（2017YFC1001604）；国家自然科学基金（81671438、81730041）；江苏省卫生厅人才项目（FRC201215、FRC201303）

DOI: 10.3760/cma.j.cn101441-20191011-00451

 

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是育龄期妇女常见的雌激素依赖性慢性炎症性疾病，与盆腔疼痛和不孕症密切相关。在育龄期女性中，EMS发病率为2%~10%，在不孕症女性中发病率升高到50%[1]。即使是轻度EMS也严重降低患者的自然妊娠率，最终有10%~25% EMS患者要借助辅助生育技术来获得妊娠[2]。EMS从卵泡发育、精卵结合、胚胎形成、子宫内膜容受性等方面影响女性生育能力。在卵泡发育过程中颗粒细胞逐渐分化成熟，合成分泌类固醇激素及卵泡液，其与卵母细胞之间良好的双向沟通是卵母细胞减数分裂恢复、胞质成熟的基础。因此，颗粒细胞功能状态在卵母细胞成熟和卵泡发育过程中发挥重要作用。本文旨在阐述EMS患者颗粒细胞凋亡和氧化应激事件的发生，EMS对颗粒细胞类固醇激素合成、线粒体能量代谢功能及卵巢储备的影响。


一.EMS患者颗粒细胞凋亡增加


卵泡颗粒细胞及膜细胞的凋亡发生介导了卵泡闭锁。当颗粒细胞内生存促进因子消耗，叉头转录因子去磷酸化后转位至细胞核，促进凋亡诱导因子转录发生[3]。Nakahara等[4]研究表明颗粒细胞内凋亡小体数量对IVF结局有预测作用，凋亡小体发生率升高时获卵率下降、空卵泡发生率上升，而EMS患者颗粒细胞中凋亡小体发生率显著高于其他原因不孕患者(输卵管因素、男方因素不孕)。同时，EMS分期升高或伴有内膜异位囊肿时，颗粒细胞凋亡小体发生率进一步增加[4]。此外，流式细胞技术分析EMS患者颗粒细胞所处细胞周期构成比显示，处于S期的颗粒细胞比例升高，而处于G2/M期的细胞比例却显著降低[4]，提示EMS对颗粒细胞增殖的抑制作用。


β-连环蛋白（β-catenin）与下游转录因子结合后促进生存素（Survivin）、骨基质形成蛋白4（BMP4）等凋亡抑制因子的表达，从而调节细胞增殖与生存[5]。在缺乏Wnt1、Wnt3的保护时，β-连环蛋白与蛋白降解复合物结合后发生磷酸化，随后被蛋白酶降解。同为Wnt家族成员的Wnt4、Wnt5对β-连环蛋白没有保护作用。在EMS患者颗粒细胞内非β-连环蛋白依赖性的Wnt4和Wnt5表达增加，β-连环蛋白依赖性的Wnt1表达下降，导致β-连环蛋白及其下游凋亡抑制靶基因表达量均下降[5]。该实验结果从β-连环蛋白-Wnt信号通路上解释了EMS患者颗粒细胞凋亡增加的原因。


睾酮在卵母细胞成熟及卵泡发育过程发挥重要作用。Yoshihiro等[6]在颗粒细胞系CV434上验证了睾酮能够通过PI3K-Akt-FoxO3a通路抑制细胞凋亡，解释了EMS患者血清及卵泡液中睾酮水平降低与其颗粒细胞凋亡增加的信号机制。


二.EMS患者颗粒细胞氧化应激与炎症反应发生


研究显示，内膜异位囊肿周围卵巢皮质氧化应激水平明显高于皮样囊肿或浆液性囊肿[7]。排卵前卵泡颗粒细胞合成代谢旺盛，快速合成类固醇激素导致副产物活性氧(ROS)簇大量堆积，使氧化物与抗氧化物比例失衡，触发细胞氧化应激，而细胞氧化应激是卵母细胞质量下降的原因之一[8]。8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）是细胞DNA损伤的敏感标志物，反映了细胞氧化应激程度，其含量升高与卵子退化、受精率下降、胚胎发育潜能降低相关，而EMS患者颗粒细胞和卵泡液中8-OHdG水平显著高于输卵管因素、男方因素不孕患者（P<0.05）[9]。


一氧化氮（NO）是存在于卵母细胞微环境中的自由基，对卵泡发育和排卵过程都起重要调节作用，而在EMS患者卵泡内NO合成代谢失调[10]。NO与氧气反应形成活性代谢产物过氧化亚硝酸离子（ONOO-），促进细胞蛋白质的酪氨酸残基硝化，导致脂质过氧化[11]。在共聚焦显微镜下观察到EMS患者颗粒细胞内ONOO-表达阳性而在对照组颗粒细胞内未检测到。同时，EMS组中未获得妊娠者卵泡液中亚硝酸盐含量高于同组中获得妊娠者[12]。这表明EMS患者颗粒细胞内氮氧化物代谢过强可能是EMS患者卵母细胞活力与发育潜能下降的原因之一。


H2DCF-DA荧光探针可以检测细胞内ROS水平，实验显示EMS患者颗粒细胞内ROS水平是输卵管因素不孕者的4倍[13]。Tunel法可检测细胞DNA碎片，荧光显微镜下见EMS组颗粒细胞DNA碎片率显著高于对照组，同时，EMS患者颗粒细胞线粒体膜电位较对照组下降7倍[14]。据此猜测EMS患者颗粒细胞内ROS增加，DNA损伤增加，线粒体膜孔通道开放，大量钙离子外流，导致线粒体膜电位下降，细胞色素C等促凋亡因子释放，激活下游凋亡因子级联反应，诱导颗粒细胞凋亡。


此外，检测EMS患者卵泡液氧化应激水平的实验结果提示：EMS患者过氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶表达下降，维生素A、维生素C、维生素E、还原型谷胱甘肽（GSH）等非酶抗氧化物质表达也下降，而ROS、NO、丙二醛（MDA）等氧化物质含量增加[13]。卵泡液中抗氧化指标下降，氧化物质指标上升，间接提示EMS患者颗粒细胞处于氧化应激状态，进而影响卵母细胞成熟与胚胎质量。


子宫内膜异位病灶种植导致盆腔免疫系统过度激活，前列腺素、炎症介质、趋化因子表达增加。单一实验结果表明：EMS患者颗粒细胞体外培养后，细胞上清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-8/1β（IL-8/1β）等炎症介质水平高于对照组[15]。核因子-κB（NF-κB）在细胞因子的激活下参与放大炎症级联反应，是细胞炎症反应的重要调节因子[16]。Ying等[16]检测EMS患者卵泡液与颗粒细胞炎症因子的表达，结果显示EMS者卵泡液中TNF-α水平增加，颗粒细胞中NF-κB表达增加，而端粒酶活性却下降。在健康卵泡中端粒酶保持较高活性，对IVF结局有预测作用[17]。由此推测EMS患者颗粒细胞内TNF-α介导NF-κB信号通路调节细胞端粒酶活性，从而影响卵泡成熟和卵母细胞质量。


1. EMS患者颗粒细胞功能异常——类固醇激素合成：卵泡发育成熟伴随颗粒细胞分化，细胞表面卵泡刺激素受体（FSHR）与黄体生成素受体（LHR）表达逐渐增多。颗粒细胞在FSH作用下经第二信使cAMP诱导下游靶基因芳香化酶表达增加，招募类固醇因子-1或激活MAPK-ERK、PI3K通路促进雌激素合成[18]。雌激素在卵泡内有促进颗粒细胞增殖、提高对促性腺激素敏感性的作用[19]。急性甾体调节蛋白(StAR)具有将胆固醇由线粒体外膜转运至内膜的作用，是颗粒细胞性激素合成的关键酶之一，EMS患者颗粒细胞中StAR表达显著降低，可能是EMS患者颗粒细胞性激素合成能力受损的原因[4]。此外，相比较于输卵管因素不孕患者，EMS患者颗粒细胞行体外培养时，无论是否添加促性腺激素或雄激素，其芳香化酶表达水平与雌孕激素水平均明显下降（P<0.05）[4]。与颗粒细胞类固醇合成能力相反的是，EMS患者异位/在位内膜细胞中雌激素活性较正常内膜明显升高[20]，而局部高雌激素环境诱导异位内膜过度增殖，从而形成恶性循环。


此外，EMS患者对孕酮治疗的低反应和无反应被称为孕酮抵抗[20]。正常生理状态，排卵后黄素化颗粒细胞分泌大量孕酮以拮抗雌激素活性，抑制子宫内膜上皮细胞增殖，促进内膜腺体分泌功能成熟，使子宫内膜蜕膜化，增加子宫内膜容受性，为胚胎种植做准备[21]。而EMS患者孕酮受体A、B亚型比例失调导致基质细胞内旁分泌因子（如维A酸）表达下降，上皮细胞内II型17β-类固醇脱氢酶的表达下降，阻碍雌二醇转化为低活性的雌酮，使局部内膜处于高雌激素状态，子宫内膜蜕膜化转变受阻，不利于胚胎种植[20]。然而，目前针对EMS患者颗粒细胞孕酮合成能力的实验结果尚无定论。3β-类固醇脱氢酶催化孕烯醇酮转变为孕酮，随后与皮质类固醇球蛋白结合转运入血，并在子宫内膜、乳腺组织等靶器官中发挥作用。Wang等[22]的实验结果提示EMS患者颗粒细胞中3β-类固醇脱氢酶和皮质类固醇球蛋白的表达与非EMS患者未见明显差异。相反，Cunha-Filho等[20]免疫组织化学结果却提示EMS患者黄素化颗粒细胞功能异常，孕酮合成显著减少。


2. EMS患者颗粒细胞功能异常——线粒体能量代谢：颗粒细胞与卵母细胞代谢合成功能十分密切，颗粒细胞内线粒体形态、线粒体DNA（mtDNA）表达丰度及ATP生成效率一定程度上影响卵母细胞发育潜能[23]。Xu等[24]通过透射电子显微镜观察到，相对于因输卵管因素行IVF患者，轻度EMS患者卵丘颗粒细胞内出现结构肿胀模糊和小空泡的异常形态线粒体数量显著增加，预示EMS患者卵丘细胞线粒体功能下降。线粒体氧化呼吸链合成细胞内约89%的ATP，是细胞产能的主要来源。卵丘细胞在解剖上与卵母细胞紧密相连，并通过缝隙连接与卵母细胞进行双向物质信号交换，EMS患者卵丘颗粒细胞线粒体结构功能异常可能影响卵母细胞成熟过程。


mtDNA参与编码呼吸链结构蛋白，其核酸序列缺失将导致细胞氧化磷酸化能力受损，ATP合成能力降低，而细胞内严重的ATP缺乏常导致凋亡发生[25]。高龄女性颗粒细胞凋亡发生常伴随一个大小约4977 bp的mtDNA片段的丢失[25]。然而Albert等[26]报道EMS患者与对照组患者颗粒细胞mtDNA与核基因组DNA分子量的比值并无差异，但前者颗粒细胞ATP合成能力下降显著（下降了65%）。同时，回归分析显示EMS患者颗粒细胞ATP合成水平与其MII卵率、妊娠率呈正性相关，提示EMS患者颗粒细胞线粒体功能异常、ATP合成下降可能促进其不良妊娠结局的发生。颗粒细胞mtDNA含量对早期胚胎发育情况有预测作用。Yoshik等[27]对比腹腔镜术后重度EMS患者与输卵管因素行IVF的患者颗粒细胞中mtDNA表达情况，结果显示EMS患者mtDNA表达明显高于对照组。可能是EMS患者卵泡内异常的微环境影响颗粒细胞能量功能，致使细胞mtDNA代偿性表达增加以弥补线粒体能量代谢缺陷。


Sirtuins蛋白家族是一群组蛋白去乙酰化酶，在不同亚细胞定位时参与调节细胞周期、能量代谢、氧化还原等作用[28]。其中定位于细胞质的SIRT2在人类颗粒细胞中高表达，参与抑制磷酸烯醇化丙酮酸羧激酶I（糖异生关键酶）的活性从而调节颗粒细胞糖代谢过程[29]。Rebeca等[30]实验结果提示，相对于供卵对照组，EMS患者、高龄患者及卵巢低反应患者的颗粒细胞中SIRT2表达均显著增高，提示在EMS患者颗粒细胞中高表达的SIRT2可能介由糖代谢调节途径影响颗粒细胞能量代谢进而导致临床妊娠率下降。


三.EMS患者卵巢储备下降


EMS根据解剖位置可以分为3类，分别是盆腔黏附型、深部浸润型和卵巢囊肿型，其中定位在卵巢皮质的内膜异位囊肿能直接影响女性卵巢储备[31]。内膜异位囊肿受累的卵巢中始基卵泡数目减少，闭锁卵泡和初级卵泡数目增加[31]。针对这一现象的解释：EMS病灶受累的卵巢发生炎症应激反应，炎症反应刺激更多原本处于休眠状态的始基卵泡被募集进入生长发育轨道，而局部病灶炎症反应使卵巢纤维化，影响卵巢血运，进入生长阶段的卵泡得不到足够营养支持后走向闭锁，因此出现患侧卵巢皮质中闭锁卵泡和进入生长轨道的初级卵泡均增加这一看似相互矛盾的现象[31]。内膜异位囊肿血红蛋白降解形成含铁血黄素，高铁离子环境激发炎症应激促使卵泡募集，卵巢血运不足又使大量生长卵泡走向闭锁，形成恶性循环，加快患侧卵泡储备耗竭。同时，近年来实验结果表明患有内膜异位囊肿的卵巢卵泡液中IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α、单核细胞趋化因子1等炎症介质含量明显升高[32-33]，进一步佐证了内膜异位囊肿通过炎症反应增加卵泡募集从而促进卵巢储备消耗的科研假说。


四.总结与展望


EMS是目前公认的女性不孕症病因之一。内膜异位囊肿对卵巢储备的破坏、EMS患者卵泡颗粒细胞凋亡和氧应激反应增加、线粒体能量代谢和类固醇激素合成功能异常都对EMS患者生育力产生负面影响。颗粒细胞正常的生理活动及功能维持与卵泡发育、卵母细胞成熟过程息息相关。因此，针对EMS患者卵泡颗粒细胞功能与细胞活动的研究可以为EMS性不孕的诊治提供新思路。


参考文献（略）