GOCM专栏丨先天性心脏病的基因检测

先天性心脏病（CHD）是最常见的先天性异常，是婴儿发病和死亡的重要原因。除了表观遗传和环境基础外，遗传学在CHD发病机制中也起着核心作用。来自美国霍普金斯大学Ying Zou教授团队发表在Gynecology and Obstetrics Clinical Medicine 2022年第3期Genetic detection of congenital heart disease的综述，介绍了既往和近期的CHD基因检测，通过对基因诊断的识别有助于预测和潜在改善CHD患者的预后（本文节选部分内容）。

PART 01 前言

先天性心脏病（CHD）是出生时最常见（通常是严重）的先天性异常，估计500名新生儿的患病率为1（范围从0.2到6）。CHD包括广泛的心脏畸形，可能还伴有心外畸形。根据心脏外先天性畸形的程度，CHD可分为综合征性和非综合征性CHD。非综合征性CHD是局限于心脏的先天性异常（伴有对心血管的影响），而综合征性CHD包括心脏和其他器官的先天性异常（独立于CHD的心外畸形）。婴儿期先进的医疗干预/治疗显着降低了 CHD死亡率，目前大多数CHD患者（>90%）可以存活到成年。患有心脏外结构或功能缺陷的CHD新生儿可能在儿童期出现神经发育迟缓。因此，了解CHD的病因和机制对于预后和治疗策略很重要。

PART 02 CHD的病因

CHD的病因是多因素的，包括遗传和环境因素。约40%的CHD病例由基因变异导致，约5%的CHD病例由环境因素导致，其余55%的CHD病例病因不明。

与一般人群相比，家族内患CHD的风险较高，孟德尔遗传模式，增加了血缘关系中出现的次数，并促进了更高的同卵双胞胎符合率，证实了遗传因素在CHD中的作用。CHD的遗传原因是非常不同的，从染色体异常到单基因改变，包括染色体拷贝数变异（CNV)，染色体异常或非整倍体，以及单基因疾病。大多数单基因疾病可归因于新的致病变异，而不是遗传致病变异（图1）。

2.1 染色体非整倍体与CHD

早在20世纪50年代就最早发现染色体非整倍体是与CHD相关的遗传缺陷，它是指整个染色体的获得（三体）或丢失（单体）。据估计，染色体非整倍体占所有CHD病例的9%~18%。21三体（唐氏综合征）是CHD最常见的基因诊断，与18三体、13三体和X单体一起构成了大多数婴儿CHD的染色体非整倍体（图1）。

2.2 先心病的缺失/重复综合征

CNV包括染色体的一部分的缺失或复制，大小从1千碱基对到几个兆碱基对不等，并可能导致基因剂量的改变。CNV发生在可遗传和初始变异的背景下，可以表现为非综合征性CHD或影响多个组织系统的综合征，占CHD的10%~15%。Lander等人估计在合并心脏外异常的CHD中，CNV占3%~25%，而在非综合征性CHD中，这一比例为3%~10%。

与 CHD 相关的最常见的人类微缺失是染色体22q11.2 缺失综合征 （Del22q11），也称为 DiGeorge 综合征和颚心脸综合症综合征，其表现为多种表型，包括 CHD、上颚异常、低钙血症、免疫缺陷、特征性面部特征和神经发育异常，例如学习障碍和精神疾病。

2.3 先心病的单基因致病因素

据估计，大约有400个人类基因参与了结构性CHD的发病或致病，但目前已有<200个基因被认为是明确相关的，这意味着大多数与CHD相关的基因还没有确定。各种非综合征型和综合征型CHD的单基因致病因素已被发现，包括编码形态发生因子、转录因子、信号转导、组蛋白/染色质修饰物、肌节和其他心脏结构蛋白的基因，这些基因对心脏发育至关重要。

与在染色体非整倍性和CNV的情况下观察到的情况相似，相比于非综合征型CHD，综合征型CHD识别单基因疾病的可能性更高。大多数导致综合征型 CHD的单基因变异是初始的，而遗传变异似乎在非综合征性CHD中更常见。

综合征型CHD往往具有高或完全外显率，而不完全外显率在非综合征型家族性CHD中最为显着。无论基因与综合征型或非综合征型CHD相关，在受影响的家庭成员中都可能出现不同的表现，如果疾病表现非常轻微，则可能无法识别。由于外显率降低和表达能力不同，散发性CHD有时可能是家族性的。

重要的是，家族性和散发性CHD都可能由于与综合征和/或非综合征CHD相关的基因的致病变异而发生。当强烈怀疑特定遗传因素时，可以通过对单个基因进行 Sanger测序来检测单基因CHD，或者当鉴别诊断列表很长或发现个体的综合征与已知疾病不符时。

重要的是，看似非综合征型CHD实际上可能是综合征型，当在胎儿中诊断出明显的非综合征CHD时尤其相关，因为子宫内成像技术可能会遗漏某些心脏外胎儿异常和神经发育障碍的特征，致使其在产前未能被识别出。因此，没有心脏外特征不应排除对综合征性CHD基因的检测。如果怀疑是由遗传病因引起的胎儿异常，包括偶发性综合征或非综合征性CHD，则需要对单基因原因进行检测。家族性CHD也需要检测单基因功能障碍。

2.4  CHD中的非编码变异

新的研究表明，非编码调节元件中的变异也可能导致病因不明的CHD。与未受影响的个体相比，CHD 先证者明显具有更多的初始变异进而影响非编码转录元件，如增强子和 RNA-结合蛋白调节位点。该研究进一步确定了与非编码的初始变异反复相关的基因，包括 SHOC2、ZNRF3、CPSF3、MAP4K4 和 COL1A2。

另外，miRNA和LncRNA对组织和器官的分化和形态发生至关重要，包括心肌的分化和形态发生。在基因的miRNA位点上或在miRNA自身中，变异所致的miRNA的失调可导致严重的CHD。例如，通常通过抑制表达来调节叶酸代谢中的关键酶的miRNA-499中的单个核苷酸变异可导致心脏早期发育异常。因此，miR-499已成为CHD的诊断性的生物标志物。

同样，在VSD患者的心脏组织中，以及在怀有超声心动图证实为CHD胎儿的母亲的血浆中也发现了LncRNA的异常表达。可以预见miRNA和LncRNA将继续在诊断、预后甚至治疗方面发挥更大的作用。

2.5 CHD的危险因素

CHD还与父系的高龄（>45岁）和遗传风险因素相关。

PART 03 影响CHD的环境因素

大约5%的CHD病例环境因素与有关（图1）。CHD与环境风险因素有关，包括母亲/父亲暴露于空气污染或有毒化学物质的环境、父母吸烟、母亲怀孕期间的传染病史、孕前和妊娠期糖尿病、孕产妇肥胖、孕产妇吸毒和怀孕、人工辅助生殖技术。母亲饮酒或喝咖啡与CHD的关联并不显着，然而，母亲补充叶酸似乎对CHD有预防作用。

尽管在心脏发育过程中，环境因素干扰分子途径的潜在机制是否会导致CHD仍然未知，已证明CHD是由基因-环境相互作用引起的，导致动物模型中CHD的发病率增加。

PART 04 CHD的复杂遗传、不完全外显和遗传修饰

超过一半的CHD患者病因不明，一些已知的CHD基因表现出不完全外显的遗传模式，这突显了CHD的遗传复杂性。当某些人表现出CHD表型时，一些家庭会发生CHD基因（例如NOTCH1、ROBO4和SMAD6）的不完全外显，而另一些人则不会，即使他们携带CHD基因中的致病变异。在外显率方面也可能存在性别偏见。

遗传或环境因素可能导致CHD临床表现的严重程度不同。除了经典的隐性或显性传递模式外，更复杂的遗传模式(如多个变异体/基因的上位性相互作用）可能在CHD的遗传异质性中发挥作用。

即使没有进行基因检测或没有确定家族中的特定遗传原因，识别出患有左心室流出道梗阻（LVOTO）畸形的胎儿也应该督促其他家庭成员，特别是父母和兄弟姐妹进行心脏评估。这是因为二尖瓣主动脉瓣（BAV）/动脉瘤综合征可能会出现不同的左流出道缺陷，包括有动脉瘤的BAV、无动脉瘤的BAV、主动脉瘤和正常的主动脉瓣，以及更严重的缺陷，包括主动脉缩窄或左心发育不良。

BAV/动脉瘤综合征以常染色体显性遗传方式遗传，可表现出外显性降低，因此在受影响的家族中可能表现为“隔代遗传”。因此，所有患有BAV/动脉瘤综合征家族的一级亲属都应该接受超声心动图检查，以检查瓣膜异常以及主动脉根部和升主动脉瘤。

PART 05 基因检测

5.1. CHD的染色体组型和FISH

可以检测到CMA无法检测到的平衡结构染色体异常。此外，对患有染色体异常（如罗伯逊易位、缺失、重复或平衡或不平衡相互易位等所致的13三体或21三体）的儿童的双亲进行核型分析也很重要。潜在的染色体异常，以评估未来怀孕复发的风险。据报道，遗传性易位会增加非整倍体复发和自然流产的风险。

5.2. CHD的染色体微阵列

基于微阵列的对比基因组杂交（CGH）和单核苷酸多态性（SNP）微阵列可以识别过于短小以致于不能通过核型这种标准细胞遗传学分析看到的亚微观CNV。CGH阵列和SNP微阵列都可以检测到全基因组的CNV；但是，SNP微阵列也可以检测到三倍体、杂合性缺失、单亲二体和嵌合体。

5.3. CHD下一代的靶向测序（致病变异）

NGS是一种大规模平行测序技术，用于识别小到核苷酸水平的遗传变异。NGS组合包括特定疾病的多个兴趣基因（例如，Noonan综合征/Rasology基因组)或一组相关疾病（例如，异位/原发纤毛运动障碍小组），或者甚至可以是包括与非综合征和综合征CHD相关的几个基因的一个CHD大组合。

先天性心脏病的NGS组合检测有时用于出生后环境，更适用于综合征性CHD，但一般来说，它不是散发性非综合征性CHD的检测原则，因为基于目前的基因检测技术的检出率较低，而这些病例中的大多数预计具有多因素病因。

5.4. CHD的全外显子组测序和全基因组测序

与NGS组合类似，WES和WGS都使用大规模平行的NGS技术，但与组合相比，WES的检测规模更大、最全面。WES可以检测的到单核苷酸变异(SNV）、小的INDELs以及涉及一个或多个外显子的CNV，已被用于CHD胎儿的检测，通常是在核型和/或CMA产生阴性结果并证实非综合征性CHD以及具有心脏外异常的综合征性CHD中可增加检出效益。

5.5. CHD的二次基因组学发现

自2013起，ACMG发布了报告WES或WGS临床上偶然发现的建议，最新版本是发布于2021年的ACMG SF v3.0列表，它包括73个基因，主要是基于相关疾病的医学可操作性，并最大限度地降低发病率和死亡率的潜力。与心血管表型相关的基因有33个，建议在征得患者的同意的情况下，临床外显子组和基因组测序中报告这些CHD相关基因的致病或可能致病变异，与检测适应症无关。

5.6. CHD的无创性产前检测

自2011年推出以来，循环脱离细胞DNA检测（cfDNA）已经彻底改变了非整倍体的非侵入性筛查。cfDNA方法分析母体循环中的由胎盘滋养层细胞释放的细胞外DNA片段（通常长度为150-200个碱基对），使用如大规模平行靶向测序（MPSS）或SNP等多种方法筛选染色体异常。

cfDNA最常用于筛查常见的非致死性非整倍体：21三体、18三体、13三体，有时还包括性染色体非整倍体，在妊娠9周就可以在临床上使用，并且已知对常见的非整倍体具有高敏感性和特异性，已迅速成为高风险和中等风险妊娠的一线非整倍体筛查工具。高风险指征包括高龄产妇、阳性血清筛查结果或异常胎儿超声发现，如软指标或先天性异常。

虽然通过绒毛膜绒毛取样 (CVS）、羊膜穿刺术或胎儿血液取样进行产前诊断仍然是妊娠期遗传病诊断的金标准，但考虑到与诊断程序相关的潜在流产风险，许多患者可能会选择 cfDNA筛查而不是诊断检测。因此，当孕妇拒绝诊断检测时，cfDNA筛查是诊断为CHD的妊娠的一种可用选择，并且对于CHD的一些最常见原因（包括唐氏综合征、X单体、18三体和13三体）仍然是一个很好的筛查。

值得注意的是，cfDNA 筛查对其他疾病（例如微缺失和单基因疾病）的检测不占优势，已知其敏感性和特异性较低。鉴于这些情况的发生率较低，亚染色体拷贝数变异的阳性预测值通常显著降低。一个新的可行的选择是筛选与高龄父亲或异常超声结果相关的选择性的、经常初始的常染色体显性遗传疾病；虽然此类筛选的临床表现数据更少。因此，应彻底告知患者选择cfDNA筛查而非诊断检测的局限性，因为正常的cfDNA结果不能排除与CHD相关的所有可能的遗传病因。

还应告知患者对先心病胎儿父母进行携带者筛查的可行性和潜在效用。携带者筛查使用各种方法，例如靶向基因分型和/或基因测序，以尝试识别有更高的风险孕育出患有常染色体隐性遗传或X连锁疾病的儿童的个体。这种筛查可以在怀孕前或怀孕期间进行，以识别有风险的夫妇，然后他们可以选择其他辅助生殖方式以降低生育异常孩子的风险，例如产前诊断、胚胎植入前基因检测、使用精子/卵母细胞供体或收养。

从历史上看，基于种族的携带者筛查是针对特定种族中少数最常见的疾病进行的。目前基因检测技术的进步和成本的降低允许在短期内同时对数百个基因进行高通量检测，许多携带者筛查实验室现在可以通过单一血液和/或唾液样本检测数百种疾病。

ACMG目前建议对携带者筛查采用与种族无关的分层方法。第1层筛查被定义为筛查囊性纤维化、脊髓性肌萎缩，以及根据个人和家族史以及其他风险因素确定的基于风险的筛查。第2层筛查定义的筛查条件为发生携带者的概率为1/100或更高。第3层筛查定义的筛查条件为发生携带者的概率为1/200或更高。第4级筛查定义为对发生携带者的概率为1/200或以下的疾病进行筛查。对于一般人群，ACMG建议提供第3级筛查。在父母血亲的情况下，或者当家庭或个人病史需要时，应考虑进行第4级筛查。

尽管为确定产前检测到的CHD胎儿的诊断而进行的携带者筛查的检出率通常很低，但有许多与CHD相关的常染色体隐性遗传疾病，并且在胎儿异常不明确的情况下，包含数百个基因大型携带者筛查组合可以为胎儿疾病“撒网”提供一种具有潜在成本效益的方法。

携带者筛查组合中可能包含的也与CHD相关的疾病，包括Smith-Lemli-Opitz综合征（OMIM 270400）、BardetBiedl综合征（OMIM PS209900）、Barth 综合征（OMIM 302060）、Ellis-van Creveld（OMIM 225500）, Fanconi贫血（OMIM PS227650）, 一些异质性疾病如 ZIC3（OMIM 300265）等等。在妊娠早期之前或在妊娠早期（后者符合胎儿表型），在携带者筛查组合上识别一对夫妇患有某一疾病的风险，可以帮助对通过绒毛膜绒毛取样 (CVS）获得的产前标本进行定向单基因检测或羊膜穿刺术。

PART 06 基因检测方法

对于伴有神经发育迟缓或心外异常的综合征型CHD，建议根据疑似疾病进行不同的基因检测方式（从核型、FISH、CMA 到测序）。非综合征型CHD进一步分类根据家族史确定为家族性或散发性CHD（图3）。建议使用CMA和测序检测（包括CHD基因组、WES和WGS）来揭示CHD的病因。

PART 07 CHD中NGS检测的最佳实践

当前在种系分析临床测序中进行变体识别的“最佳实践”是三人家系模式。先证者和父母双方的联合（同时）能够通过原始父母对变体进行定位。三人家系模式联合变异检测的一个关键优势是能够区分先证者的初始改变，这占临床基因检测CHD阳性诊断的很大一部分。

PART 08 遗传咨询的作用

以患者为中心的最佳、全面的CHD管理需要协作的多学科团队方法，遗传咨询是对包括CHD在内的超声异常胎儿的诊断评估的关键组成部分。鉴于CHD的临床和病因学异质性，CHD遗传基础的知识库的迅速扩大、以及细胞遗传学和分子分析的复杂性，冠心病的遗传咨询可能是复杂的。

医学遗传学家和遗传咨询师可以获得完整的病史和孕产史（包括可能的致畸暴露），构建三代人的家族史，制定鉴别诊断，确定适当的检测策略，促进决策，协调基因检测，解释结果，提供复发风险咨询，并讨论未来怀孕的可用筛查和检测。

PART 09 结论及未来展望

了解CHD病因的基因检测不仅对于CHD患者的诊断、分类和临床管理很重要，而且对于现在处于生育年龄且生育患有CHD儿童风险增加的CHD患者的产前管理也很重要。NGS极大地推动了CHD遗传病因学的发现，包括单基因变异、拷贝数和结构变异。鉴于其实用性的不断增强和成本的降低，NGS正在迅速取代Sanger测序和CMA作为评估CHD中SNV和CNV的方法。由于孤立的CHD病因可能因多基因原因、体细胞嵌合、表观遗传效应和基因-环境相互作用而更加复杂，因此WES或WGS方法超越单基因效应将提高诊断率。

尽管我们目前对CHD的遗传病因有一定了解，但未来揭示CHD所涉及的病因的完整图景仍有许多工作要做，因为超过一半的CHD患者的病因仍然未知。新的CHD基因很可能通过优先招募不同的患者或通过关注特定人群的CHD基因型来发现，因为CHD表型在不同的祖先群体之间是独一无二的。

使用单细胞RNA测序、ChIP-seq、ATAC-seq、甲基化（表观基因组学）谱和蛋白质生物标志物谱的功能基因组研究揭示了更复杂的遗传网络，对CHD的特定心脏遗传谱系产生影响，并正在全面评估非编码变异和寡基因变异在CHD病因中的作用。从人类CHD组织的直接分析中破译环境暴露对异常基因表达的影响可能会导致了解CHD中的环境-基因关系。

最后，与患者表型数据相关的体外/体内数据的积累开始为临床医生提供资源，用以将人类基因发现应用于 CHD患者的临床管理。这些技术进步将改善CHD患者的临床管理并丰富人类心脏发育和基因组生物学的基础知识。

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原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2667164622000574

本文内容来自Elsevier合作期刊Gynecology and Obstetrics Clinical Medicine(GOCM)第二卷第3期发表的“Genetic detection of congenital heart disease”的部分内容

DOI：doi.org/10.1016/j.gocm.2022.07.005

引用格式：Rachamadugu SI,Miller KA, Lee IH, et al. Genetic detection of congenital heart disease. Gynecol Obstet Clin Med.2021;2(3). in press.

原文摘要：

来源：GOCM杂志